Complicanze
Metodo di determinazione degli androgeni minori
Marco Caputo
Synlab Med srl, Calenzano (FI)
(aggiornamento novembre 2021)
Androstenedione è un ormone steroideo a 19 atomi di carbonio, che serve come precursore di testosterone ed estrone. Viene sintetizzato principalmente dal deidroepiandrosterone (DHEA), mediante la 3ß-idrossisteroido deidrogenasi nell’ovaio, nel testicolo e nel surrene. Come tutti gli steroidi, viene dosato idealmente con metodi basati sulla separazione cromatografica, anche se oggi i metodi immunometrici hanno trovato una vasta applicazione per la loro semplicità, praticità ed economicità. Tipicamente, questi dosaggi automatizzati si basano su un immunodosaggio competitivo a una fase, con rivelazione in chemi-luminescenza. L’androstenedione nel campione del paziente compete con aptene marcato (ad esempio con estere di acridinio) per legarsi con un anticorpo anti-androstenedione monoclonale attaccato a una fase solida. Esiste una relazione inversa tra la quantità di androstenedione presente nel campione del paziente e la quantità di RLU (Relative Light Units, unità di luce relative) rilevata dal sistema. Sono riportate interferenze farmacologiche con alcune molecole (es. exemestano e formestano), che possono dare valori falsamente elevati. Anche la presenza di biotina può contribuire a generare risultati falsamente elevati. La presenza di anticorpi eterofili nel campione può provocare risultati falsamente ridotti o falsamente elevati. Ovviamente i risultati devono sempre essere valutati alla luce del quadro clinico.
Il DHEAS è secreto nel flusso ematico a una velocità appena maggiore rispetto al DHEA, ma ha un turn-over molto più lento e un'emivita di quasi un giorno intero. Diversamente dal cortisolo, il DHEAS non mostra importanti variazioni diurne e, diversamente dal testosterone, non circola legato alla SHBG. La sua abbondanza, insieme alla sua stabilità nelle 24 ore e giorno dopo giorno, fa del DHEAS un eccellente indicatore di produzione androgena surrenalica. La determinazione del DHEA-S è eseguita routinariamente con metodi immunometrici diretti senza estrazione o cromatografia. Sono comunque oggi disponibili metodi non isotopici in fase omogenea, che possono essere automatizzati. Di converso, poiché la concentrazione del DHEA ha un ordine di grandezza 1000 volte inferiore a quella del DHEA-S, può essere misurata solo dopo una procedura di estrazione (con diclorometano ed etil-acetato) o di separazione cromatografica. Molto usati sono gli immunodosaggi competitivi che utilizzano una tecnologia in chemi-luminescenza diretta. Si impiegano particelle magnetiche di streptavidina come fase solida, anticorpi anti-DHEAS marcati con biotina come coniugato di cattura e un DHEAS coniugato marcato con estere di acridinio. L'anticorpo anti-DHEAS e il complesso DHEAS marcato con estere di acridinio sono catturati dalla fase solida, con sviluppo del segnale. Esiste una relazione inversa tra la quantità di DHEAS presente nel campione del paziente e la quantità di RLU rilevata dal sistema. I campioni dei pazienti che contengono anticorpi eterofili possono reagire nei metodi immunologici producendo risultati falsamente elevati o ridotti. I pazienti in trattamento con biotina ad alte dosi possono avere risultati falsamente sovrastimati.
Nell’adulto, le concentrazioni sieriche di DHT sono oggi misurate accuratamente con la cromatografia liquida abbinata alla doppia spettrometria di massa (LC-MS/MS) e sono disponibili anche intervalli di riferimento coerenti.
Bibliografia
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- Swerdloff RS, Dudley RE, Page ST. Dihydrotestosterone: biochemistry, physiology, and clinical implications of elevated blood levels. Endocr Rev 2017, 38: 220–54.
- Payne AH, Hales DB. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocr Rev 2004, 25: 947-70.
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Metodo di determinazione della copeptina
Marco Caputo
Synlab Med srl, Calenzano (FI)
(aggiornamento marzo 2023)
La scelta di misurare la copeptina al posto di AVP è dovuta alla sua maggiore praticabilità in termini di stabilità e praticità operativa, oltre alla comprovata affidabilità come complemento alla diagnostica delle alterazioni del bilancio dell’acqua.
I metodi più diffusi sono quelli in immuno-fluorescenza omogenea automatizzata, che utilizzano un doppio tracciante fluorescente. L’intensità del segnale è direttamente proporzionale alla concentrazione di copeptina nel campione.
Possibili interferenze:
- sepsi, shock settico, infezioni bronchiali, BPCO e cardio-vasculopatie intercorrenti possono indurre aumenti aspecifici di concentrazione ematica della copeptina;
- terapie con antagonisti della vasopressina, altre patologie che coinvolgano la secrezione di vasopressina, inducono un aumento di concentrazione ematica di copeptina;
- sono stati riportati casi di aumenti di copeptina ectopica prodotta da carcinomi bronchiali;
- l’interpretazione del dato in caso di diabete insipido centrale o periferico può essere complicata dall’incompleta espressione clinica della patologia;
- anticorpi eterofili (specialmente anti-topo) possono produrre risultati inaccurati per sovrastima o sottostima. Il laboratorio dovrebbe essere avvertito in caso di discrepanza del risultato con il quadro clinico.
Campione: plasma in EDTA (tappo lilla). Campioni emolizzati non sono accettabili.
Preparazione paziente: è indicato il digiuno e l’astensione da liquidi, inclusa acqua, nelle 8 ore precedenti il prelievo.
Conservazione: stabile 7 giorni a 4-8°C, dopo va congelato.
Riferimenti
Metodo di determinazione del testosterone
Marco Caputo
Synlab Med srl, Calenzano (FI)
(aggiornamento novembre 2021)
Il testosterone circola nel sangue periferico in diverse forme:
- legato alla SHBG (circa 40-50%);
- legato (meno fortemente) all’albumina (40-50%);
- libero da legami proteici (1-2%).
La prima forma è praticamente inattiva dal punto di vista fisiologico e rappresenta una specie di deposito circolante che viene rilasciato molto lentamente per trasformarsi in una delle altre due forme, che sono prontamente disponibili per i tessuti (testosterone biodisponibile).
In determinate condizioni fisiopatologiche si verificano variazioni significative della concentrazione di SHBG. In questo caso aumenta anche la concentrazione di testosterone totale, anche se in realtà questo aumento non è in grado di causare variazioni fisiologiche significative. Al contrario, in caso di riduzione della concentrazione di SHBG, diminuirà anche la concentrazione del testosterone totale, nonostante un incremento di testosterone biodisponibile. Esempi comuni di queste condizioni sono l’obesità (SHBG ridotta, ridotto il testosterone totale ma non il biodisponibile) e l’invecchiamento (aumenta SHBG e testosterone totale ma non il biodisponibile). Comunque, nei grandi obesi il testosterone diminuisce in tutte le sue quote.
I metodi maggiormente utilizzati oggi sono quelli immunometrici, con rilevazione in chemi-luminescenza. Tipicamente, nei dosaggi competitivi il testosterone nel campione compete con un aptene marcato (es. con acridinio) per legarsi con un anticorpo monoclonale anti-testosterone. Un successivo passaggio con un reagente libera la molecola legata con le proteine di trasporto. Esiste una relazione inversa tra la quantità di testosterone presente nel campione del paziente e la quantità di RLU (Relative Light Units, unità di luce relative) rilevata dal sistema.
La diffusione dei metodi diretti è legata ai loro vantaggi: velocità, necessità di volume ridotto di campione, eliminazione di reagenti isotopici. Alcuni di questi metodi hanno sufficiente precisione e buona correlazione con i metodi LC-MS nei campioni provenienti da maschi adulti, ma spesso non hanno sensibilità sufficiente per i campioni provenienti dalle femmine e dai soggetti pre-puberi e hanno un’accuratezza non soddisfacente.
Tutti gli immuno-dosaggi per la determinazione del testosterone hanno reazione crociata per il diidro-testosterone (DHT), ma reazioni crociate trascurabili per gli altri androgeni. Nella maggior parte delle situazioni cliniche è possibile stimare la concentrazione del testosterone anche se la sua misurazione non è preceduta dalla separazione del DHT, poiché la concentrazione di questo non supera il 10-20% della concentrazione di testosterone.
Il metodo di riferimento per la determinazione del testosterone libero è la dialisi all’equilibrio, di difficile esecuzione e quindi raramente impiegato. Gli altri metodi utilizzati, come la precipitazione del testosterone legato, il calcolo degli indici androgenici e, soprattutto, quello diretto dell’analogo, non sono affidabili, come concluso dall’Expert Panel dell’Endocrine Society, che raccomanda di interpretare i risultati solo conoscendo il metodo utilizzato:
- l’intervallo di riferimento deve essere specifico per quel metodo;
- i referti devono essere corredati dalle informazioni relative al metodo utilizzato;
- i metodi diretti NON devono essere usati nella donna, nei bambini e nei pazienti ipogonadici;
- la comparabilità dei metodi NON è la stessa in tutti i campioni;
- la fase follicolare è il momento del ciclo più adatto per studiare un sospetto iperandrogenismo.
Nel caso i livelli di testosterone totale non siano chiaramente dirimenti per la diagnosi di ipogonadismo (zona grigia), potranno essere eventualmente integrati con il calcolo della frazione libera, impiegando formule che utilizzano i dosaggi di testosterone totale, albumina e SHBG (come quella utilizzabile presso ISSAM).
Dal 2010, il CDC ha lanciato un programma di standardizzazione per il testosterone con il coinvolgimento di società scientifiche e aziende produttrici, che ha consentito significativi progressi nell’affidabilità degli immuno-dosaggi.
Negli anni recenti è aumentato l’interesse nel testosterone salivare: poiché il testosterone salivare è separato completamente dalle proteine, la sua determinazione riflette la vera concentrazione dell’ormone attivo. Ma al momento il test non trova impiego nella routine corrente.
Bibliografia
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- Vesper HW, Botelho JC. Standardization of testosterone measurements in humans. J Steroid Biochem Mol Biol 2010, 121: 513–9.